<제시문1>
효소는 복잡한 단백질 분자로 되어 있다. 촉매활성은 광학 특이성이 있는 기질의 결합자리와 촉매중심을 형성할 수 있도록 특이한 아미노산의 R원자단을 병렬로 연결한 고도의 질서성을 가진 정밀한 3차구조에서 나온다. 3차구조는 많은 수의 약한 비공유결합으로 유지되고 있다.
효소분자는 매우 정교하고 연약한 구조로 되어있다. 분자가 지나치게 많은 에너지를 흡수하면 3차 구조기가 파열돼 효소가 불활성화되어 활성을 잃게 된다. 따라서 온도가 증가하면 효소 기질 충돌횟수의 증가에 따른 속도 증가가 변성률을 증대시킨다.
<제시문2>
PCR에서 사용되는 DNA중합효소(Taq DNA polymerase)는 약 75도의 온천물에 사는 Thermus aquaticus라는 박테리아로부터 분리된 것으로 열에 안정하다. Taq 중합효소는 2가닥의 DNA 가닥들을 풀어지게 하는 온도보다 높은 온도에서도 안정하므로, PCR 증폭이 빠르고 자동적으로 수행될 수 있다.
예를 들어,한 분자의 DNA를 30회 복제해 증폭시키면 이론적으로 230 (10억)개의 복사 DNA가 만들어질 수 있기 때문에 한 분자의 DNA는 중폭되어 쉽게 검출 될 수 있는 양이 생산된다. 어떤 유전자의 존재 유무 확인(친족, 범인, 실종자 등의 신원확인), 유전자 검사(유전질병, 돌연변이, 바이러스 감염), 유전자 클로닝, 유전자 발현 정도의 측정 등에 이용된다.
<논제1>
논제 1에서 효소 단백질의 열 변성 범위인 40도 이상에서는 효소의 활성을 잃게 된다. PCR 기법에서 사용되는 DNA 중합효소의 열안정성에 관하여 설명하여라.
<논제2>
실제로 세균의 염색체에서 특정한 PCR 산물을 얻고자 할 때, 짧은 프라이머를 사용하지 않고 약 20개의 뉴클레오티드로 된 프라이머를 사용한다. 그 이유를 설명하시오.
<논제3>
제시문 2를 사용하여 DNA 증폭과정을 3단계 과정으로 실험 디자인하여라.
<출제의도>
화학과 생물과목에서 효소의 촉매기능에 영향을 주는 온도, pH, 농도를 주제로 여러 문제가 나온다. 특히 온도에 따른 열변성은 실생활에서 많이 관찰할 수 있다. 계란 반숙이나 멸균장치 등을 흔히 든다. 여기서 현대생물학에 큰 영향을 준 DNA증폭 기술을 주제로 하였다.
[예시답안]
1. 효소의 열 안정성은 pH, 이온강도, 배위자의 유무 등의 여러 가지 인자에 좌우된다. 기질은 온도 변성에 대해 보호하는 역할도 한다. 하나의 폴리펩티드 연쇄와 디셜파이드 결합을 가진 저분자량의 효소는 고분자량의 효소보다도 대개 열에 더 안정하다. 일반적으로 효소는 효소 이외의 과농도의 단백질을 함유한 정제되지 않은 반응액인 경우 더욱 안정하다.
Taq 중합효소는 소수성 아미노산 함유량이 많아서 고온의 온천에서 서식하는 고대박테리아의 DNA중합반응을 할 수 있다.
2. 프라이머와 주형과의 잡종화(hybridization)에 대한 특이성(specificity)를 높여준다. 뉴클레오티드를 2개로하면 42 base pair당 약 1개의 결합이 생기고, 20개로하면 420 base pair당 약 1개의 결합이 생기지만 시간적 소요가 길어진다. 예를 들면 주형가닥이 GGAACCTT라고하자. 프라이머를 염기 1개를 사용하게 되면(A,G,T,C) 중합효소는 결합할 장소가 2군데 생기게 되므로 원하는 DNA 가닥이 나오지 않는다. 그러므로 최소한 염기 2개를 사용해야한다. 즉 41<8개 염기<42 경우이기 때문이다. 420 base pair 이하의 염기 숫자를 가진 세균의 염색체 증폭에는 최소한 20개 정도의 프라이머가 흔히 사용된다.
3. 소량의 DNA으로 동일한 DNA를 대량 합성하기 위해서 DNA 프라이머, 4종류의 dNTP, Taq 중합효소(열에 매우 안정 )를 준비한다.
①반응액을 가열(94℃)하여 이중나선 DNA를 단일사슬로 분리(denaturation)한다.
②냉각(55℃)하여 상기 분리된 각 DNA 단일 사슬에 상보적 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 시발물질(primer)을 단일 사슬과 결합(annealing)시킨다.
③가열(72℃)하여 DNA 중합효소에 의한 시발물질의 신장(extension) 과정으로 이루어진다. ④이 과정을 반복적으로 하여 DNA를 증폭시킨다.
김진호ㆍ고려학원 이과논술팀장
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